这个试验的原理是当人们吃进糖类食物后，血糖升高，高血糖就会刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，胰岛素使血糖转运到细胞内，约餐后两小时，血糖恢复到7。8毫摩尔每升以下，或恢复到空腹水平。试验的方法是在试验前三天内，每日的碳水化合物摄入量不少于150毫克。试验前停用可能影响糖耐量试验的药物，如避孕药等3到7天。试验前一周停用噻唑烷二酮类药物，在试验前两天停用磺脲类药。停用药物的五个半衰期视为已经排除药物的影响。注射胰岛素的病人在注射前两天停用超长效胰岛素类似物，前一天停用中效或长效胰岛素，前12个小时停用超短效的胰岛素，以免外源性的胰岛素对测试的结果产生影响。
空腹抽第一次血，抽血后将无水葡萄糖粉75克，溶于300毫升左右的水中，在五分钟之内将糖水喝完。从喝第一口葡萄糖水开始算时间，分别于半小时、一小时、两小时、三小时各抽一次血测血糖。需要注意的是血标本随着搁置时间的延长，血糖的测试值要衰减，所以应当把血清标本放在四度的冰箱冷藏室内保存，血标本不能放到冷冻室内，血液结冰会溶血，影响测试的结果。在试验过程中，不能喝茶和咖啡，不能吸烟，不能做剧烈的运动，但是无需卧床。